生产我国廉价碳源储量丰富

2.2 廉价碳源的微生物利用

实现低成本PHAs生产，寻找经济可行且稳定高效合成PHAs的酵法聚羟基脂进展发酵物料是关键，尤其是生产占发酵物料总成本70%–80%的碳源替代物。合理利用廉价碳源，肪酸尤其是研究工农业废弃物料，能够有效降低PHAs的微生物生产成本，增加PHAs的酵法聚羟基脂进展市场竞争力。

2.2.1 农业廉价碳源

作为农业大国，生产我国廉价碳源储量丰富。肪酸玉米淀粉经液化、研究糖化、微生物灭酶处理后用于发酵生产增加了使用成本，酵法聚羟基脂进展因此开发直接利用玉米淀粉的生产PHAs生产菌株十分重要。Shamala等筛选出一株能同时实现α-淀粉酶分泌和PHAs积累的肪酸芽孢杆菌Bacillus sp.CFR-67。相比于30 g/L的研究葡萄糖，当以30 g/L玉米淀粉作为碳源时，CFR-67的生物量和PHAs分别提高了25%和50%。如果同时添加5 g/L的麦麸和米糠水解液，CFR-67的生物量达到10 g/L，PHAs含量升高至5.9 g/L。地中海富盐菌Haloferax mediterranei ATCC 33500利用膨化玉米淀粉和膨化米糠作为复合碳源时生物量达到140 g/L，PHAs产量达到77.8 g/L。由此可见，直接利用玉米淀粉可以实现高生物量和高PHAs的积累。近年来也有研究人员尝试将米糠、麦麸等农业废弃物用作PHAs的发酵碳源。米糠含有19.9%(W/W)的淀粉和19.5%(W/W)的脂肪，经水解后可以被重组大肠杆菌E.coli XL1-Blue和真氧产碱杆菌Ralstonia eutropha NCIMB11599用作合成PHB的碳源。

秸秆经生物炼制得到的纤维素和木质素同样可以作为PHAs生产的碳源。Li按照葡萄糖︰木糖︰阿拉伯糖=4︰2︰1的比例模拟纤维素水解液验证其用于PHAs生产的可能性。结果显示，伯克霍尔德氏菌Burkholderia sacchari DSM 17165的PHAs产量占生物量的77%，达到67 g/L。木质素的利用效果远低于纤维素，贪铜菌Cupriavidus basilensis B-8利用处理后的木质素合成PHAs得率仅482.7 mg/L。

2.2.2 甘蔗炼糖行业廉价碳源

甘蔗炼糖行业中的副产物糖蜜和蔗渣都是生产低成本PHAs的理想碳源。以稀释后的甘蔗糖蜜为碳源，枯草芽孢杆菌B.subtilis RS1经过48 h发酵后生物量达到9.5 g/L，PHAs含量达到生物量的70.5%。另一株B.subtilis以酸处理后的甘蔗糖蜜为碳源，经过96 h发酵后生物量达到38.98 g/L，PHAs含量32.25 g/L，PHAs占生物量82.99%。相比于糖蜜，蔗渣的利用难度稍大。蔗渣经酸水解后除木糖(16.9 g/L)和葡萄糖(9.7 g/L)外还含有糠醛、乙酸等毒性物质。在10 L发酵罐中进行的分批发酵实验证明洋葱伯克氏菌Burkholderia cepacia IPT 048和B.sacchari IPT 101可以利用蔗渣水解液发酵生产PHAs，且这两株菌的生物量都达到4.4 g/L，其中PHAs含量分别达到生物量的53%和62%。当仅以木糖和葡萄糖作为混合碳源时，这两株菌株的生物量都能够达到60 g/L，PHAs含量占比60%。这表明蔗渣水解液中的毒性物质对细胞积累PHAs影响极大，是未来实现高效利用蔗渣水解液的阻碍之一。

2.2.3 生物柴油行业廉价碳源

生物柴油行业每生产100 kg生物柴油将产生10 kg粗甘油，其中甘油占比75%。据报道钩虫贪铜菌C.necator DSM 545可以以粗甘油为底物合成PHB，尽管占比可以达到生物量的59.8%，但是生物量只有5.7 g/L。此外DSM 545可以将丙酮酸和粗甘油作为共同碳源合成P(3HB-4HB-3HV)，其中生物量达到45 g/L，PHAs产量达到16.7 g/L，PHAs占比36.9%。同样地，苏云金芽孢杆菌B.thuringiensis EGU45直接利用粗甘油可以实现3.16 g/L生物量和1.83 g/L PHAs的积累。研究结果证明粗甘油可以作为PHAs生产的廉价碳源，尤其是其产量大、成本低以及环境无污染等特性，都为生产低成本PHAs提供了可能性。但是目前研究结果发现利用粗甘油无法达到PHAs的高产量积累，通过基因工程手段或发酵调控策略提高粗甘油利用率或许是未来实现粗甘油利用的发展方向之一。

2.2.4 废水废料

工农业废水废料中富含的有机质通过酸化或厌氧发酵后转化成的挥发性脂肪酸(Volatile fatty acid，VFAs)，是微生物生产PHAs的高效廉价碳源。在1 L发酵罐中，R.eutropha H16能够将工农业废水转化的VFAs作为碳源和底物能量完成P(3HB-co-3HV)的积累。经48 h发酵后，生物量达到112 g/L，其中PHAs占比83.3%。在江苏省无锡市芦村进行的100 L发酵罐中试实验中，Jia等同样利用酸化后的污水沉淀物实现了PHAs的微生物转化，其中PHAs产量可以达到生物量的59.47%。除工农业废水废料外，生活产生的废弃生物质，例如豌豆皮、土豆皮、洋葱皮等[30]生物质资源经酸化后同样可以转化为VFAs，最后用于低成本PHAs的生产。

除此之外，表1中还列举了其他可以用于低成本PHAs生产的碳源，例如石油炼制过程中的甲苯、乙苯、二甲苯等苯系化合物、奶酪加工过程中的乳清，油炸食品加工过程中的废弃橄榄油、棕榈油、葵花籽油等植物油。用于微生物发酵生产低成本PHAs的理想碳源种类丰富，其中来自农业、工业、城市排放和餐余垃圾的废弃物料来源广、体量大，更适用于低成本PHAs的生产。但是大部分廉价物料经预处理后碳源浓度低、碳源成分复杂多样、毒性化合物存在、生物量低等问题为后期发酵策略的开发提出了新的挑战。

2.3 高密度发酵策略调控

实现PHAs的高密度发酵是生产低成本PHAs的必要条件之一。当PHAs产量相同时，高密度发酵所需的发酵体积更少，在人工成本、设备成本和能源消耗上都会有明显降低。

2.3.1 高密度发酵策略

PHAs的高密度发酵主要围绕“饱-饥”策略展开，即通过控制特定营养元素的浓度实现菌株先积累生物量再积累PHAs的多阶段发酵调控。补料分批发酵技术和连续发酵技术是实现高密度发酵最常用的两个技术手段。Huschner等以氮元素为营养限制条件，按照0–16 h C/N=10、16–36 h C/N=90和36–48 h C/N=∞(乙酸330.9 g/L、丙酸147.3 g/L、丁酸106.7 g/L)的调控策略实现了R.eutropha H16的高密度发酵，其中生物量达到112 g/L，PHAs占比83.3%。Ye等同样以氮元素为限制条件实现了H.bluephagenesis TD01发酵过程的精准控制。发酵18 h时TD01细胞数量达到1010个并在随后的发酵过程中保持不变，后续流加的高浓度葡萄糖(800 g/L)全部用于PHAs合成。当发酵结束后TD01生物量达到90 g/L，PHAs占比74%。

Atlic等利用5级连续发酵罐实现了C.necator DSM545的连续发酵生产，其中流出发酵液的生物量81 g/L，PHAs占比77%。5级连续发酵罐中的第一个发酵罐用于DSM545菌体数量的培养，其余发酵罐均用于氮元素限制下的PHA积累，PHAs生产速率达到1.85 g/(L·h)(补料中葡萄糖浓度500 g/L)。上述策略中都要求使用高浓度补料液以减少对发酵体系的影响，显然纤维素水解液、粗甘油等低碳浓度的廉价物料无法满足这一要求。于是Haas等开发了一种含有微滤膜出口的发酵罐，发酵清液经微滤膜出口流出，细胞则被保留在发酵罐中。当以50 g/L的葡萄糖作为补料液时得到生物量148 g/L，PHB占比76%的结果。这一策略巧妙地避免了低糖浓度补料导致的发酵体积增大、细胞逃逸等问题，尤其是为后期开发利用低浓度廉价碳源提供了思路。

2.3.2 碳源浓度控制

高密度发酵过程中碳源浓度过高过低或频繁波动都会严重影响细胞PHAs合成的能力。Shang等发现葡萄糖浓度保持9 g/L时R.eutropha可以表现出优异的PHAs积累能力，而当葡萄糖浓度在8–12 g/L范围内波动时，PHAs的积累量也会出现2%的波动。Alcaligenes eutrophus NCIMB11599、H.bluephagenesis TD01等菌株也被证实在发酵液中的葡萄糖浓度为10 g/L，即接近于其半速系数时，菌株可以实现PHAs的高效合成。结果表明控制发酵液中的碳源浓度，有利于提高高密度发酵过程中的PHAs积累量。

2.3.3 溶氧水平控制

溶氧水平是影响高密度发酵的重要因素之一。高密度发酵后期溶氧量急速降低形成微氧或无氧环境，PHAs合成代谢途径受抑制，积累量降低。尽管提高搅拌转速、通气量或者供给富氧空气可以保证高密度发酵后期的溶氧水平，但是这些举措增加了PHAs的生产成本。基因工程手段的应用解决了菌株在微氧情况下的适应问题。例如导入乙醇脱氢酶启动子Padh E的重组E.coli JW2294在微氧环境中实现了7.8 g/L生物量，64%PHB的积累。导入由8个透明颤菌血红蛋白启动子串联的P8vgb片段的重组E.coli S17-1在微氧环境中的PHB占比达到90%。随后研究人员发现在重组Halomonas sp.LS21中表达透明颤菌血红蛋白可以提高细胞在微氧环境中对氧气的摄取能力，发酵结束后生物量达到30.21 g/L，PHB占比75.32%。由此可见利用微氧启动子、或者提高细胞对氧气的摄取能力都可以维持细胞在微氧环境下的胞内正常代谢表达。

2.3.4 毒性物质影响

毒性物质积累是影响高密度发酵的另一个重要因素。高密度发酵过程中毒性物质的不断积累导致细胞活力降低甚至死亡，最终影响发酵产量。连续传代进化是目前提高菌株耐受性最常用、也是最有效的方法。为了解决乙酸、乳酸、富马酸和甲醇富集导致菌株代谢能力降低的问题，人造高密度发酵体系被用于H.bluephagenesis TDHCD-R0的连续传代进化。经过3轮筛选后的TDHCD-R3在生物量和PHAs积累方面出现明显增长。相比于出发菌株，TDHCD-R3生物量提高了41.7%，PHAs产量提高了8.2%。连续传代进化同样适用于微生物菌群的优化。可以高效利用北京市小红门污水处理厂废液废料的微生物菌群经过4轮连续传代进化后才适用于江苏省无锡市芦村污水处理厂废液废料，其中PHAs积累量达到菌体生物量的59.47%，远高于出发微生物菌群的PHAs占比(21.5%)。微生物菌群的连续传代进化可以优化菌群结构、提高底物选择能力，甚至菌群在过量氮源和非VFA存在情况下不积累PHAs的现象都得到了缓解。

2.4 开放式发酵策略开发

微生物发酵法产PHAs过程中能源消耗的费用占总成本的30%，其中主要集中于无菌化处理过程，如设备灭菌、培养基灭菌等的蒸汽消耗。因此有研究者提出“下一代工业生物技术(Next-generation industrial biotechnology，NGIB)”，即一种开放式连续发酵生物工业技术。

目前NGIB中成功用于PHAs生产的Halomonas sp.TD01是清华大学陈国强团队从艾丁湖筛选获得的耐盐耐碱菌株，在高盐高碱的环境下可以保持PHAs的高效合成。盐单胞菌TD01已经实现了中试级别的开放式补料分批发酵和连续发酵，这一过程中发酵物料、设备以及补料无需进行灭菌操作，大大减少了灭菌过程的能源消耗。另一株嗜盐菌H.campaniensis LS21以按照厨余垃圾和海水成分配制的模拟培养基(其中Na Cl浓度为27 g/L，p H为10)实现了连续65 d的开放式发酵，经基因工程改造后的重组H.campaniensis LS21在同样条件下实现了生物量70%的PHB积累。这为未来直接利用厨余垃圾和海水进行开放式无灭菌发酵提供了可能性。研究团队发现发酵过程及下游分离提取过程中产生的高盐废水在无需预处理的情况下可以再次实现4批次的PHAs发酵。这不但减少了新水及Na Cl的使用量，还同时解决了高盐高碱发酵废水的处理排放问题。

NGIB的核心是获得一株可以抵抗噬菌体或其他菌种感染的底盘微生物。因此可以用于开发生产PHA的底盘微生物种类繁多，例如在高碱无灭菌培养基中生产乙醇的耐盐碱马氏芽孢杆菌Bacillus marmarensis、在50℃高温无灭菌培养基中生产乳酸的凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans WCP10-4等，以及自然界中存在的嗜酸、嗜碱等嗜极微生物都可以开发用作低成本PHAs发酵生产的底盘微生物。

3 展望

随着白色污染的加重和石油资源的枯竭，绿色环保材料必将取代传统石油基塑料。被认为是未来最有前景的绿色环保材料PHAs由于其高昂的生产成本在推广应用中受到了极大的限制，因此实现低成本PHAs的工业化生产是目前的研究重点。目前利用合成生物学、基因工程以及代谢工程等手段，菌株合成PHAs的能力已经得到明显提升，但依然无法满足工业化生产要求。未来的研究方向将主要集中到两个方面：(1)开发低成本物料利用技术。例如利用农业秸秆、餐余垃圾和废水废料等废弃物料，降低PHAs发酵生产的物料成本。(2)开发NGIB。寻找高效积累PHA的嗜极微生物，实现PHAs的开放式发酵生产，能够进一步推动低成本PHAs的工业化生产进程。

声明：本文所用图片、文字来源《生物工程学报》2021年2月，版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系

相关链接：发酵，芽孢杆菌，纤维素，乙醇脱氢酶

- END -